البـــــوابـــة
Cette méthode d’analyse permet de dénombrer les bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies
(BHAA) facultatives présentes dans un échantillon d’eau. Elle est une mesure quantitative des
bactéries viables sur un milieu de culture déterminé. Les bactéries dénombrées requièrent de la
matière organique comme source de carbone (hétérotrophes) et sont cultivées à des températures
optimales situées entre 20 °C et 45 °C (mésophiles) avec ou sans présence d’oxygène (aérobies et
anaérobies facultatives). Cette méthode permet d’isoler et de dénombrer un groupe relativement
varié d’espèces de bactéries sans égard à leur étiologie (pathogénicité).
Cette méthode ne permet pas de revivifier et de dénombrer toutes les bactéries présentes dans un
échantillon d’eau. En effet, les populations microbiennes présentes dans des milieux aquatiques
pauvres en substances nutritives subissent des carences importantes et ces conditions les rendent
extrêmement sensibles au choc de la température inhérent à la technique proposée. De plus, aucune
méthode, milieu de culture ou ensemble de conditions physiques ne peut satisfaire les exigences
physiologiques de toutes les espèces bactériennes présentes dans un échantillon d’eau.
Le nombre et la variété de bactéries qui se multiplient sont influencés par des facteurs tels que la
durée de la période d’incubation, la concentration partielle en oxygène, le pH du milieu, la présence
de matières nutritives spécifiques dans le milieu de culture, la compétition entre les bactéries pour
les nutriments, etc.
Néanmoins, cette méthode permet d’obtenir une appréciation globale de la contamination et une
évaluation de la salubrité générale d’un milieu donné sans toutefois préciser les sources de
contamination. Généralement, un faible dénombrement de BHAA dans l’eau permet d’en apprécier
sa bonne qualité, alors qu’un dénombrement atteignant quelques milliers par millilitre peut
témoigner d’une pollution d’origine organique.
La présence d’un nombre élevé de bactéries hétérotrophes dans l’eau d’un réseau de distribution
peut en affecter la qualité en occasionnant un mauvais goût et de mauvaises odeurs ou en favorisant
des conditions de dégradation biologique et de persistance de pathogènes tels que Pseudomonas
aeruginosa et Aeromonas hydrophila. De plus, la présence abondante de BHAA peut poser des
problèmes dans le traitement d’une eau de consommation en rendant difficile le maintien d’une
concentration résiduelle de chlore aux extrémités du réseau de distribution. Finalement, une valeur
limite de 500 unités formant des colonies (UFC) par millilitre a été fixée pour l’eau de
consommation traitée afin de limiter principalement les interférences lors de l’analyse des
coliformes totaux.
Cette méthode correspond à la méthode 9215B, intitulée « Pour Plate Method (Heterotrophic
Plate Count) », du manuel Standard Methods for the Examination of Water and Wasterwater
(APHA, AWWA et WEF, 1998).
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1. DOMAINE D’APPLICATION
La présente méthode consiste à dénombrer les bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies
facultatives (BHAA) par incorporation à la gélose.
Le dénombrement des BHAA s’effectue après incubation à 35 °C pendant 48 heures lorsqu’un
aperçu général de la qualité de l’eau est désiré. Cette température reflète les conditions de vie des
mésophiles et favorise la récupération de celles-ci. Le dénombrement après incubation à 35 °C
pendant 48 heures est surtout utilisé pour l’évaluation d’une eau de consommation d’un réseau
de distribution, car il permet de vérifier l’efficacité du traitement.
2. PRINCIPE ET THÉORIE
La méthode de dénombrement des BHAA par incorporation à la gélose consiste à dénombrer les
microorganismes viables présents dans une portion d’échantillon d’eau. Elle s’effectue en déposant
une portion d’un échantillon d’eau dans une boîte de Pétri à laquelle est ajoutée de la gélose R2A,
maintenue liquéfiée à environ 45 °C. La ou les boîtes de Pétri sont ensuite agitées doucement afin
de répartir uniformément les bactéries dans tout le volume de milieu disponible. La ou les boîtes de
Pétri sont ensuite laissées à refroidir sur une surface au niveau et incubées à 35, 0 °C ± 0, 5 °C
pendant 48 heures ± 3 heures. L’incubation dans ces conditions permet à chaque bactérie viable de
se multiplier et de former un amas de cellules (colonies) permettant leur dénombrement à l’aide
d’un compteur de colonies. Le milieu de culture étant non sélectif, toutes les espèces de bactéries
supportant les conditions du test pourront croître et ainsi être dénombrées.
3. FIABILITÉ
3.1. INTERFÉRENCE
Les bouteilles d’échantillonnage de 250 ml remplies à pleine capacité ne permettent pas d’agiter
l’échantillon et de disperser uniformément les bactéries présentes dans tout le volume initial. Le
rejet d’une portion de l’échantillon au laboratoire risquerait de modifier la concentration initiale des
bactéries par unité de volume de l’échantillon et de fausser le résultat. L’analyse de tels échantillons
doit faire l’objet d’une remarque à cet effet dans le rapport d’analyse.
La récupération des bactéries peut être affectée par le choc de température occasionné par la gélose
liquéfiée maintenue entre 44 °C et 46 °C. Il faut éviter que la température de la gélose excède 46 °C,
car des bactéries viables pourraient être détruites. Le niveau d’eau du bain-marie qui maintient la
température entre 44 °C et 46 °C doit être plus élevé que le niveau de la gélose dans les bouteilles.
La gélose utilisée pour l’analyse doit être maintenue liquéfiée entre 44 °C et 46 °C pendant un
maximum de 3 heures. Elle ne doit jamais être liquéfiée une seconde fois après la stérilisation.
De plus, elle ne doit pas être utilisée si un précipité est visible dans le milieu.
Les bactéries ne doivent pas demeurer en suspension dans l’eau de dilution pendant plus de
30 minutes à la température ambiante, car il peut en résulter une variation de la population initiale.
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La gélose doit être versée dans des boîtes de Pétri posées sur une surface au niveau afin d’obtenir
une épaisseur uniforme.
Les manipulations doivent être effectuées sur une surface non poreuse, désinfectée, dans un endroit
du laboratoire à l’abri de courants d’air. Ces précautions sont nécessaires car le milieu de culture
non sélectif utilisé permet la croissance de plusieurs microorganismes trouvés dans l’air et sur les
surfaces de travail d’un laboratoire. La désinfection des surfaces de travail avant l’analyse est donc
essentielle pour obtenir des résultats fiables.
Lorsque des microorganismes envahissent en partie ou en entier la surface de la gélose,
le dénombrement des bactéries recherchées peut être affecté.
Le milieu de culture doit être stérilisé dans les 2 heures qui suivent sa préparation, car il peut en
résulter une dégradation de sa qualité nutritive à la suite de la croissance de microorganismes.
Après la fin du cycle de stérilisation, éviter de laisser séjourner le milieu dans l’autoclave, car la
chaleur de l’appareil suffit à modifier le milieu, principalement les sucres.
3.2. LIMITE DE DÉTECTION
La limite de détection pour cette méthode est de 1 UFC (unités formant des colonies) par ml.
3.3. LIMITE DE QUANTIFICATION
Les limites de quantification, inférieure et supérieure, pour cette méthode sont respectivement de
30 et 300 UFC de BHAA par volume d’échantillon analysé.
3.4. FIDÉLITÉ
3.4.1. Répétabilité
Trois tests de répétabilité ont été réalisés dans le laboratoire du CEAEQ. Dix replica de trois
échantillons différents fabriqués avec des cultures pures de E. coli et d’Enterobacter cloacae ont
été analysés par une seule technicienne. Les coefficients de variation ont été de 11, 12 et 7 %
pour des concentrations moyennes respectives de 600, 300 et 700 UFC/ml.
4. PRÉLÈVEMENT ET CONSERVATION
Les échantillons doivent toujours être prélevés avec toutes les conditions d’asepsie nécessaires
dans des contenants stériles de verre ou de polypropylène à large ouverture, de capacité
d’environ 250 ml, en laissant un espace d’air d’au moins 2,5 cm.
De plus, les contenants utilisés pour le prélèvement des échantillons d’eau probablement chlorée
doivent contenir une solution de thiosulfate de sodium (Na2S2O3) dont la concentration finale est
d’au moins 100 mg/l dans l’échantillon. Pour obtenir ce résultat, introduire 2,5 ml d’une solution
de thiosulfate de sodium à 1 % (1 g de Na2S2O3 par 100 ml d’eau) dans un contenant de 250 ml
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avant de le stériliser. Le thiosulfate de sodium agit comme agent neutralisant du chlore résiduel
qui pourrait être présent dans l’eau. Il empêche ainsi le chlore d’agir entre le moment du
prélèvement et celui de l’analyse et permet donc d’obtenir le nombre réel de microorganismes
présents dans l’eau au moment du prélèvement.
Une étude réalisée dans nos laboratoires sur les eaux de consommation a permis d’établir que le
délai maximal admissible pour l’analyse était de 48 heures après le prélèvement et que
l’échantillon devrait être protégé contre les effets de la température à l’aide d’un isolant
thermique ou être réfrigéré pendant le transport.
À leur réception au laboratoire, les échantillons qui ne peuvent être analysés dans les 4 heures qui
suivent leur arrivée doivent être placés au réfrigérateur jusqu’au moment de leur analyse.
Les échantillons reçus congelés dans des contenants non conformes ou selon des délais de
prélèvements inacceptables (> 48 heures) ne doivent pas être analysés.
5. APPAREILLAGE
5.1. Barre magnétique
5.2. Boîtes de Pétri d’environ 100 mm x 15 mm
5.3. Bouteilles à dilution
5.4. Désinfectant pour surfaces de travail
5.5. Hygromètre
5.6. Pipettes stériles 10,0 ml et 1,0 ml de type TD
5.7. Thermomètres (graduation de 0,5 °C)
5.8. Bouteille de verre avec bouchon autoclavable
5.9. Autoclave
5.10. Bain d’eau bouillante
5.11. Bain-marie à 45 °C ± 1 °C
5.12. Balance analytique avec une précision de 0,01 g
5.13. Brûleur à gaz
5.14. Compteur de colonies
5.15. Incubateur à 35,0 °C ± 0,5 °C
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5.16. pH-mètre
5.17. Plaque chauffante avec agitateur magnétique
5.18. Réfrigérateur maintenant une température entre 2 °C et 6 °C
6. MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS
Tous les réactifs commerciaux utilisés sont de qualité A.C.S., à moins d’indication contraire.
L’eau utilisée pour la préparation des milieux de culture et des réactifs est de l’eau distillée,
déminéralisée ou ultra-pure. Les marques de commerce apparaissant ci-dessous ne sont
mentionnées qu’à titre de renseignement.
6.1. Hydroxyde de sodium, NaOH (CAS no 1310-73-2)
Solution commerciale 10 N.
6.2. Acide chlorhydrique, HCl (CAS no 7647-01-0)
Solution commerciale 1 N.
6.3. Phosphate de potassium anhydre, KH2PO4 (CAS no 7778-77-0)
6.4. Solution d’hydroxyde de sodium 1 N
Ajouter 100 ml de la solution commerciale de NaOH 10 N (cf. 6.1) dans environ 700 ml
d’eau et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Cette solution se conserve à la température
ambiante.
6.5. Gélose R2A
Ce milieu est disponible dans le commerce sous forme déshydratée. Il est utilisé à raison
de 18,2 g/l et sa formulation tel que présentée par le fabricant est la suivante :
Formule en grammes par litre d’eau :
Extrait de levure 0,5 g
Protéose peptone no 3 0,5 g
Acides casamino 0,5 g
Dextrose 0,5 g
Amidon soluble 0,5 g
Pyruvate de sodium 0,3 g
Phosphate de potassium dibasique 0,3 g
Sulfate de magnésium 0,05 g
Agar 15,0 g
Dans un erlenmeyer de 2 000 ml, peser 18,2 grammes de milieu déshydraté et ajouter
1 000 ml d’eau purifiée. Porter le milieu à ébullition (ne pas laisser bouillir) sur une plaque
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chauffante jusqu’à dissolution complète en remuant avec un agitateur magnétique. Le pH
final doit être de 7,2 ± 0,2 à 25 °C. Si nécessaire, ajuster le pH avec une solution de
HCl 1 N (cf. 6.2) ou de NaOH 1 N (cf. 6.4). Répartir dans des bouteilles de verre avec
bouchon. Stériliser les bouteilles à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Après la stérilisation, laisser refroidir la gélose à la température ambiante et visser
hermétiquement les bouchons sur les bouteilles. Entreposer celles-ci au réfrigérateur à
4 °C à l’obscurité pendant quatre semaines au maximum. Lors de l’utilisation, faire
fondre la gélose dans un bain d’eau bouillante et transférer ensuite les bouteilles dans le
bain-marie à 45 °C ± 1 °C pendant 3 heures au maximum.
Placer un thermomètre dans une bouteille supplémentaire de milieu de culture qui subira
le même traitement thermique que les autres bouteilles. Cette bouteille sert de témoin de
température.
6.6. Solution tampon phosphate
Dissoudre 34, 0 g de KH2PO4 anhydre (cf. 6.3) dans environ 500 ml d’eau, ajuster le pH à
7,2 avec une solution de NaOH 1 N (cf. 6.4) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Cette
solution se conserve à 4 °C.
6.7. Eau tamponnée de dilution
Ajouter 1,25 ml de la solution tampon phosphate (cf. 6.6) par litre d’eau. Répartir dans des
bouteilles de 150 ml en volumes suffisants pour obtenir un volume final de
90 ml ± 2,0 ml après autoclavage à 121 °C pendant 15 minutes. L’eau tamponnée de
dilution se conserve deux mois à 4 °C.
7. PROTOCOLE D’ANALYSE
Pour toute série d’échantillon, les recommandations des « Lignes directrices concernant
l’application des contrôles de la qualité en microbiologie », DR-12-SCA-02, sont suivies et tous
les éléments de contrôle et d’assurance de la qualité nécessaires sont réalisés en conformité à ces
lignes directrices.
7.1. Préparation de l’échantillon
Désinfecter la surface de travail avec un produit approprié. Identifier les boîtes de Pétri avec le
numéro d’échantillon, la dilution et tout autre renseignement jugé utile.
Tous les échantillons doivent être homogénéisés en agitant vigoureusement les bouteilles d’un
mouvement vertical.
La dilution de l’échantillon est parfois requise pour obtenir un dénombrement de 30 à 300 colonies
au moment de l’observation des résultats. Pour la plupart des échantillons d’eau de consommation
traitée, il est possible d’obtenir cet intervalle en ensemençant 1,0 ml et 0,1 ml de l’échantillon non
dilué. Il n’est donc pas nécessaire d’effectuer de dilution.
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Les eaux de consommation non traitées et les eaux brutes peuvent nécessiter plusieurs dilutions.
Effectuer ces dilutions de la façon suivante :
− prélever aseptiquement 10,0 ml de l’échantillon à l’aide d’une pipette stérile et l’introduire
dans une bouteille contenant 90,0 ml d’eau tamponnée de dilution (cf. 6.7).
Agiter vigoureusement.
Effectuer la dilution suivante (si nécessaire) en prélevant aseptiquement 10,0 ml de la dilution
précédente pour l’introduire dans une bouteille de 90,0 ml d’eau de dilution stérile. Agiter
vigoureusement.
NOTE - La pipette doit être changée entre chaque dilution et le prélèvement d’une
portion de l’échantillon avec une pipette doit s’effectuer en plongeant celle-ci à
environ 2,5 cm sous la surface du liquide.
7.2. ANALYSE DE L’ÉCHANTILLON
Vous trouverez à la figure 1 le schéma analytique de la méthode.
− Prélever aseptiquement à l’aide d’une pipette stérile les volumes requis (par exemple
1,0 et 0,1 ml) de l’échantillon et les déposer dans les boîtes de Pétri (100 mm x 15 mm)
préalablement identifiées. Le couvercle de la boîte de Pétri doit être entrouvert au
minimum pour déposer l’inoculum afin de minimiser les risques de contamination.
− Verser ensuite de 15 ml à 17 ml de gélose R2A (cf. 6.5) tempérée à 45 °C ± 1 °C dans
chaque boîte de Pétri.
− Mélanger doucement l’inoculum et la gélose par rotation des boîtes de Pétri dans le sens
horaire, dans le sens antihoraire et dans un mouvement avant-arrière et latéral. Ne pas
éclabousser la gélose dans le couvercle de la boîte de Pétri.
− Laisser solidifier les géloses sur une surface plane au niveau.
− Placer les géloses dans l’incubateur à 35 °C ± 0,5 °C en position inversée pendant
48 heures ± 3 heures.
Un contrôle de stérilité doit être effectué de la façon suivante :
− verser de 15 ml à 17 ml de gélose R2A tempérée à 45 °C ± 1 °C dans une boîte de Pétri.
Laisser solidifier sur une surface au niveau. Il est recommandé d’effectuer un contrôle de
stérilité par série de 10 échantillons.
7.3. OBSERVATION DES RÉSULTATS
Après la période d’incubation, sortir et ranger les boîtes de Pétri par ordre de numéro d’échantillon.
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7.3.1. Dénombrement
Effectuer les dénombrements à l’aide d’un compteur de colonies. Choisir les boîtes de Pétri dans
lesquelles il y a entre 30 et 300 colonies.
7.3.2. Enregistrement des résultats
Inscrire sur la feuille de travail le nombre de colonies correspondant au volume d’eau analysé et
reporter le résultat par ml.
8. CALCUL ET EXPRESSION DES RÉSULTATS
Les résultats doivent être calculés à l’aide de l’équation générale suivante :
Volume d échantillon analysé en ml
Nombre de colonies dénombrées
UFC ml
′
=
8.1. DÉNOMBREMENT À L’INTÉRIEUR DES LIMITES DE QUANTIFICATION
Les limites de quantification étant situées à 30 et 300 colonies, calculer le résultat en ne retenant que
les boîtes de Pétri contenant entre 30 et 300 colonies.
Exemple :
Si des volumes de 0,1 ml et de 0,01 ml d’un échantillon produisent des dénombrements de 250 et
14 colonies, conserver la valeur de 250 colonies pour exprimer le résultat :
2 500 UFC ml
0,1 ml
250
=
8.2. DÉNOMBREMENT À L’EXTÉRIEUR DES LIMITES DE QUANTIFICATION
8.2.1. Dénombrement lorsque le nombre de colonies isolées est inférieur à la limite de
quantification
Lorsque toutes les géloses analysées contiennent moins de 30 colonies, additionner toutes les
colonies sur l’ensemble des géloses, tout en tenant compte des volumes de l’échantillon
ensemencés.
Exemple :
Si des volumes de 1 ml, 0,1 ml et 0,01 ml d’un échantillon produisent respectivement 28, 4 et
0 colonies, le résultat est le suivant :
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29 UFC ml
1 0,1 0,01
28 4 0
=
+ +
+ +
8.2.2. Dénombrement lorsque aucune colonie n’a été isolée sur les boîtes de Pétri correspondant
à plusieurs volumes analysés d’un échantillon
Calculer le résultat à l’aide du volume d’échantillon le plus grand.
Exemple :
Si des volumes de 0,1 ml, 0,01 ml et 0,001 ml d’un échantillon produisent tous des comptes de
0 colonie, calculer le nombre de colonies par ml qui aurait été rapporté s’il y avait 1 colonie sur la
gélose du plus grand volume d’échantillon utilisé :
10 UFC ml
0,1 ml
1
=
Transmettre ce résultat comme étant :
< 10 UFC/ml
8.2.3. Dénombrement lorsque tous les résultats de plusieurs volumes d’un échantillon sont
au-delà de la limite supérieure de quantification
Calculer le résultat à l’aide de la limite de quantification et du plus faible volume d’échantillon
utilisé.
Exemple :
Si des volumes de 1,0 ml, 0,1 ml et 0,01 ml d’un échantillon produisent respectivement 540, 390 et
320, tous les comptes sont au-delà de la limite de quantification. Estimer le résultat à l’aide du plus
petit volume utilisé et de la limite supérieure de quantification (300 pour les BHAA).
30 000 UFC ml
0,01 ml
300
=
Transmettre ce résultat comme étant :
> 30 000 UFC/ml
8.3. DÉNOMBREMENT EN PRÉSENCE DE COLONIES ENVAHISSANTES
Dans le cas où des colonies envahissantes sont présentes, compter les colonies distinctes et les
colonies envahissantes suivant les conditions énumérées ci-dessous :
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8.3.1. Dénombrement des colonies distinctes
Dénombrer toutes les colonies distinctes si les colonies envahissantes ne couvrent pas plus de la
moitié de la surface de la gélose.
Si les colonies envahissantes couvrent plus de la moitié de la surface de la gélose, rapporter
qualitativement le résultat comme étant : « présence de colonies envahissantes ».
8.3.2. Dénombrement des colonies envahissantes
Dénombrer comme uniques les colonies envahissantes qui sont bien définies et séparées ainsi que
celles différentes par leur aspect.
S’il est impossible de différencier les colonies envahissantes, rapporter qualitativement le résultat
comme étant : « présence de colonies envahissantes ».
9. CRITÈRES D’ACCEPTABILITÉ
Les contrôles de stérilité effectués au moment de l’analyse doivent démontrer l’absence de colonies
de BHAA ou de tout autre microorganisme.
La température de l’incubateur doit être maintenue à 35,0 °C ± 0,5 °C pendant toute la durée de
l’incubation.
Toutes les exigences précisées dans le document DR-12-SCA-02, intitulé « Lignes directrices
concernant l’application des contrôles de la qualité en microbiologie », doivent être respectées.
10. BIBLIOGRAPHIE
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS
ASSOCIATION AND WATER POLLUTION CONTROL FEDERATION, Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th Edition, 1998.
CENTRE D’EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC, Lignes
directrices concernant l’application des contrôles de la qualité en microbiologie,
Ministère de l’Environnement du Québec, DR-12-SCA-02, Édition courante.
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Échantillon
dilutions
transfert des volumes d’échantillon dans les boîtes de Pétri
ajout du milieu R2A à 45 °C ± 1 °C
mélange de l’inoculum et du milieu R2A
solidification des milieux
incubation à 35 °C ± 0,5 °C 48 heures ± 3 heures
dénombrement des colonies
Figure 1 - Schéma du protocole de confirmation des colonies hétérotrophes aérobies et
anaérobies facultatives (BHAA)
(BHAA) facultatives présentes dans un échantillon d’eau. Elle est une mesure quantitative des
bactéries viables sur un milieu de culture déterminé. Les bactéries dénombrées requièrent de la
matière organique comme source de carbone (hétérotrophes) et sont cultivées à des températures
optimales situées entre 20 °C et 45 °C (mésophiles) avec ou sans présence d’oxygène (aérobies et
anaérobies facultatives). Cette méthode permet d’isoler et de dénombrer un groupe relativement
varié d’espèces de bactéries sans égard à leur étiologie (pathogénicité).
Cette méthode ne permet pas de revivifier et de dénombrer toutes les bactéries présentes dans un
échantillon d’eau. En effet, les populations microbiennes présentes dans des milieux aquatiques
pauvres en substances nutritives subissent des carences importantes et ces conditions les rendent
extrêmement sensibles au choc de la température inhérent à la technique proposée. De plus, aucune
méthode, milieu de culture ou ensemble de conditions physiques ne peut satisfaire les exigences
physiologiques de toutes les espèces bactériennes présentes dans un échantillon d’eau.
Le nombre et la variété de bactéries qui se multiplient sont influencés par des facteurs tels que la
durée de la période d’incubation, la concentration partielle en oxygène, le pH du milieu, la présence
de matières nutritives spécifiques dans le milieu de culture, la compétition entre les bactéries pour
les nutriments, etc.
Néanmoins, cette méthode permet d’obtenir une appréciation globale de la contamination et une
évaluation de la salubrité générale d’un milieu donné sans toutefois préciser les sources de
contamination. Généralement, un faible dénombrement de BHAA dans l’eau permet d’en apprécier
sa bonne qualité, alors qu’un dénombrement atteignant quelques milliers par millilitre peut
témoigner d’une pollution d’origine organique.
La présence d’un nombre élevé de bactéries hétérotrophes dans l’eau d’un réseau de distribution
peut en affecter la qualité en occasionnant un mauvais goût et de mauvaises odeurs ou en favorisant
des conditions de dégradation biologique et de persistance de pathogènes tels que Pseudomonas
aeruginosa et Aeromonas hydrophila. De plus, la présence abondante de BHAA peut poser des
problèmes dans le traitement d’une eau de consommation en rendant difficile le maintien d’une
concentration résiduelle de chlore aux extrémités du réseau de distribution. Finalement, une valeur
limite de 500 unités formant des colonies (UFC) par millilitre a été fixée pour l’eau de
consommation traitée afin de limiter principalement les interférences lors de l’analyse des
coliformes totaux.
Cette méthode correspond à la méthode 9215B, intitulée « Pour Plate Method (Heterotrophic
Plate Count) », du manuel Standard Methods for the Examination of Water and Wasterwater
(APHA, AWWA et WEF, 1998).
6 de 15 MA. 700 – BHA35 1.0
1. DOMAINE D’APPLICATION
La présente méthode consiste à dénombrer les bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies
facultatives (BHAA) par incorporation à la gélose.
Le dénombrement des BHAA s’effectue après incubation à 35 °C pendant 48 heures lorsqu’un
aperçu général de la qualité de l’eau est désiré. Cette température reflète les conditions de vie des
mésophiles et favorise la récupération de celles-ci. Le dénombrement après incubation à 35 °C
pendant 48 heures est surtout utilisé pour l’évaluation d’une eau de consommation d’un réseau
de distribution, car il permet de vérifier l’efficacité du traitement.
2. PRINCIPE ET THÉORIE
La méthode de dénombrement des BHAA par incorporation à la gélose consiste à dénombrer les
microorganismes viables présents dans une portion d’échantillon d’eau. Elle s’effectue en déposant
une portion d’un échantillon d’eau dans une boîte de Pétri à laquelle est ajoutée de la gélose R2A,
maintenue liquéfiée à environ 45 °C. La ou les boîtes de Pétri sont ensuite agitées doucement afin
de répartir uniformément les bactéries dans tout le volume de milieu disponible. La ou les boîtes de
Pétri sont ensuite laissées à refroidir sur une surface au niveau et incubées à 35, 0 °C ± 0, 5 °C
pendant 48 heures ± 3 heures. L’incubation dans ces conditions permet à chaque bactérie viable de
se multiplier et de former un amas de cellules (colonies) permettant leur dénombrement à l’aide
d’un compteur de colonies. Le milieu de culture étant non sélectif, toutes les espèces de bactéries
supportant les conditions du test pourront croître et ainsi être dénombrées.
3. FIABILITÉ
3.1. INTERFÉRENCE
Les bouteilles d’échantillonnage de 250 ml remplies à pleine capacité ne permettent pas d’agiter
l’échantillon et de disperser uniformément les bactéries présentes dans tout le volume initial. Le
rejet d’une portion de l’échantillon au laboratoire risquerait de modifier la concentration initiale des
bactéries par unité de volume de l’échantillon et de fausser le résultat. L’analyse de tels échantillons
doit faire l’objet d’une remarque à cet effet dans le rapport d’analyse.
La récupération des bactéries peut être affectée par le choc de température occasionné par la gélose
liquéfiée maintenue entre 44 °C et 46 °C. Il faut éviter que la température de la gélose excède 46 °C,
car des bactéries viables pourraient être détruites. Le niveau d’eau du bain-marie qui maintient la
température entre 44 °C et 46 °C doit être plus élevé que le niveau de la gélose dans les bouteilles.
La gélose utilisée pour l’analyse doit être maintenue liquéfiée entre 44 °C et 46 °C pendant un
maximum de 3 heures. Elle ne doit jamais être liquéfiée une seconde fois après la stérilisation.
De plus, elle ne doit pas être utilisée si un précipité est visible dans le milieu.
Les bactéries ne doivent pas demeurer en suspension dans l’eau de dilution pendant plus de
30 minutes à la température ambiante, car il peut en résulter une variation de la population initiale.
MA. 700 – BHA35 1.0 7 de 15
La gélose doit être versée dans des boîtes de Pétri posées sur une surface au niveau afin d’obtenir
une épaisseur uniforme.
Les manipulations doivent être effectuées sur une surface non poreuse, désinfectée, dans un endroit
du laboratoire à l’abri de courants d’air. Ces précautions sont nécessaires car le milieu de culture
non sélectif utilisé permet la croissance de plusieurs microorganismes trouvés dans l’air et sur les
surfaces de travail d’un laboratoire. La désinfection des surfaces de travail avant l’analyse est donc
essentielle pour obtenir des résultats fiables.
Lorsque des microorganismes envahissent en partie ou en entier la surface de la gélose,
le dénombrement des bactéries recherchées peut être affecté.
Le milieu de culture doit être stérilisé dans les 2 heures qui suivent sa préparation, car il peut en
résulter une dégradation de sa qualité nutritive à la suite de la croissance de microorganismes.
Après la fin du cycle de stérilisation, éviter de laisser séjourner le milieu dans l’autoclave, car la
chaleur de l’appareil suffit à modifier le milieu, principalement les sucres.
3.2. LIMITE DE DÉTECTION
La limite de détection pour cette méthode est de 1 UFC (unités formant des colonies) par ml.
3.3. LIMITE DE QUANTIFICATION
Les limites de quantification, inférieure et supérieure, pour cette méthode sont respectivement de
30 et 300 UFC de BHAA par volume d’échantillon analysé.
3.4. FIDÉLITÉ
3.4.1. Répétabilité
Trois tests de répétabilité ont été réalisés dans le laboratoire du CEAEQ. Dix replica de trois
échantillons différents fabriqués avec des cultures pures de E. coli et d’Enterobacter cloacae ont
été analysés par une seule technicienne. Les coefficients de variation ont été de 11, 12 et 7 %
pour des concentrations moyennes respectives de 600, 300 et 700 UFC/ml.
4. PRÉLÈVEMENT ET CONSERVATION
Les échantillons doivent toujours être prélevés avec toutes les conditions d’asepsie nécessaires
dans des contenants stériles de verre ou de polypropylène à large ouverture, de capacité
d’environ 250 ml, en laissant un espace d’air d’au moins 2,5 cm.
De plus, les contenants utilisés pour le prélèvement des échantillons d’eau probablement chlorée
doivent contenir une solution de thiosulfate de sodium (Na2S2O3) dont la concentration finale est
d’au moins 100 mg/l dans l’échantillon. Pour obtenir ce résultat, introduire 2,5 ml d’une solution
de thiosulfate de sodium à 1 % (1 g de Na2S2O3 par 100 ml d’eau) dans un contenant de 250 ml
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avant de le stériliser. Le thiosulfate de sodium agit comme agent neutralisant du chlore résiduel
qui pourrait être présent dans l’eau. Il empêche ainsi le chlore d’agir entre le moment du
prélèvement et celui de l’analyse et permet donc d’obtenir le nombre réel de microorganismes
présents dans l’eau au moment du prélèvement.
Une étude réalisée dans nos laboratoires sur les eaux de consommation a permis d’établir que le
délai maximal admissible pour l’analyse était de 48 heures après le prélèvement et que
l’échantillon devrait être protégé contre les effets de la température à l’aide d’un isolant
thermique ou être réfrigéré pendant le transport.
À leur réception au laboratoire, les échantillons qui ne peuvent être analysés dans les 4 heures qui
suivent leur arrivée doivent être placés au réfrigérateur jusqu’au moment de leur analyse.
Les échantillons reçus congelés dans des contenants non conformes ou selon des délais de
prélèvements inacceptables (> 48 heures) ne doivent pas être analysés.
5. APPAREILLAGE
5.1. Barre magnétique
5.2. Boîtes de Pétri d’environ 100 mm x 15 mm
5.3. Bouteilles à dilution
5.4. Désinfectant pour surfaces de travail
5.5. Hygromètre
5.6. Pipettes stériles 10,0 ml et 1,0 ml de type TD
5.7. Thermomètres (graduation de 0,5 °C)
5.8. Bouteille de verre avec bouchon autoclavable
5.9. Autoclave
5.10. Bain d’eau bouillante
5.11. Bain-marie à 45 °C ± 1 °C
5.12. Balance analytique avec une précision de 0,01 g
5.13. Brûleur à gaz
5.14. Compteur de colonies
5.15. Incubateur à 35,0 °C ± 0,5 °C
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5.16. pH-mètre
5.17. Plaque chauffante avec agitateur magnétique
5.18. Réfrigérateur maintenant une température entre 2 °C et 6 °C
6. MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS
Tous les réactifs commerciaux utilisés sont de qualité A.C.S., à moins d’indication contraire.
L’eau utilisée pour la préparation des milieux de culture et des réactifs est de l’eau distillée,
déminéralisée ou ultra-pure. Les marques de commerce apparaissant ci-dessous ne sont
mentionnées qu’à titre de renseignement.
6.1. Hydroxyde de sodium, NaOH (CAS no 1310-73-2)
Solution commerciale 10 N.
6.2. Acide chlorhydrique, HCl (CAS no 7647-01-0)
Solution commerciale 1 N.
6.3. Phosphate de potassium anhydre, KH2PO4 (CAS no 7778-77-0)
6.4. Solution d’hydroxyde de sodium 1 N
Ajouter 100 ml de la solution commerciale de NaOH 10 N (cf. 6.1) dans environ 700 ml
d’eau et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Cette solution se conserve à la température
ambiante.
6.5. Gélose R2A
Ce milieu est disponible dans le commerce sous forme déshydratée. Il est utilisé à raison
de 18,2 g/l et sa formulation tel que présentée par le fabricant est la suivante :
Formule en grammes par litre d’eau :
Extrait de levure 0,5 g
Protéose peptone no 3 0,5 g
Acides casamino 0,5 g
Dextrose 0,5 g
Amidon soluble 0,5 g
Pyruvate de sodium 0,3 g
Phosphate de potassium dibasique 0,3 g
Sulfate de magnésium 0,05 g
Agar 15,0 g
Dans un erlenmeyer de 2 000 ml, peser 18,2 grammes de milieu déshydraté et ajouter
1 000 ml d’eau purifiée. Porter le milieu à ébullition (ne pas laisser bouillir) sur une plaque
10 de 15 MA. 700 – BHA35 1.0
chauffante jusqu’à dissolution complète en remuant avec un agitateur magnétique. Le pH
final doit être de 7,2 ± 0,2 à 25 °C. Si nécessaire, ajuster le pH avec une solution de
HCl 1 N (cf. 6.2) ou de NaOH 1 N (cf. 6.4). Répartir dans des bouteilles de verre avec
bouchon. Stériliser les bouteilles à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Après la stérilisation, laisser refroidir la gélose à la température ambiante et visser
hermétiquement les bouchons sur les bouteilles. Entreposer celles-ci au réfrigérateur à
4 °C à l’obscurité pendant quatre semaines au maximum. Lors de l’utilisation, faire
fondre la gélose dans un bain d’eau bouillante et transférer ensuite les bouteilles dans le
bain-marie à 45 °C ± 1 °C pendant 3 heures au maximum.
Placer un thermomètre dans une bouteille supplémentaire de milieu de culture qui subira
le même traitement thermique que les autres bouteilles. Cette bouteille sert de témoin de
température.
6.6. Solution tampon phosphate
Dissoudre 34, 0 g de KH2PO4 anhydre (cf. 6.3) dans environ 500 ml d’eau, ajuster le pH à
7,2 avec une solution de NaOH 1 N (cf. 6.4) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Cette
solution se conserve à 4 °C.
6.7. Eau tamponnée de dilution
Ajouter 1,25 ml de la solution tampon phosphate (cf. 6.6) par litre d’eau. Répartir dans des
bouteilles de 150 ml en volumes suffisants pour obtenir un volume final de
90 ml ± 2,0 ml après autoclavage à 121 °C pendant 15 minutes. L’eau tamponnée de
dilution se conserve deux mois à 4 °C.
7. PROTOCOLE D’ANALYSE
Pour toute série d’échantillon, les recommandations des « Lignes directrices concernant
l’application des contrôles de la qualité en microbiologie », DR-12-SCA-02, sont suivies et tous
les éléments de contrôle et d’assurance de la qualité nécessaires sont réalisés en conformité à ces
lignes directrices.
7.1. Préparation de l’échantillon
Désinfecter la surface de travail avec un produit approprié. Identifier les boîtes de Pétri avec le
numéro d’échantillon, la dilution et tout autre renseignement jugé utile.
Tous les échantillons doivent être homogénéisés en agitant vigoureusement les bouteilles d’un
mouvement vertical.
La dilution de l’échantillon est parfois requise pour obtenir un dénombrement de 30 à 300 colonies
au moment de l’observation des résultats. Pour la plupart des échantillons d’eau de consommation
traitée, il est possible d’obtenir cet intervalle en ensemençant 1,0 ml et 0,1 ml de l’échantillon non
dilué. Il n’est donc pas nécessaire d’effectuer de dilution.
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Les eaux de consommation non traitées et les eaux brutes peuvent nécessiter plusieurs dilutions.
Effectuer ces dilutions de la façon suivante :
− prélever aseptiquement 10,0 ml de l’échantillon à l’aide d’une pipette stérile et l’introduire
dans une bouteille contenant 90,0 ml d’eau tamponnée de dilution (cf. 6.7).
Agiter vigoureusement.
Effectuer la dilution suivante (si nécessaire) en prélevant aseptiquement 10,0 ml de la dilution
précédente pour l’introduire dans une bouteille de 90,0 ml d’eau de dilution stérile. Agiter
vigoureusement.
NOTE - La pipette doit être changée entre chaque dilution et le prélèvement d’une
portion de l’échantillon avec une pipette doit s’effectuer en plongeant celle-ci à
environ 2,5 cm sous la surface du liquide.
7.2. ANALYSE DE L’ÉCHANTILLON
Vous trouverez à la figure 1 le schéma analytique de la méthode.
− Prélever aseptiquement à l’aide d’une pipette stérile les volumes requis (par exemple
1,0 et 0,1 ml) de l’échantillon et les déposer dans les boîtes de Pétri (100 mm x 15 mm)
préalablement identifiées. Le couvercle de la boîte de Pétri doit être entrouvert au
minimum pour déposer l’inoculum afin de minimiser les risques de contamination.
− Verser ensuite de 15 ml à 17 ml de gélose R2A (cf. 6.5) tempérée à 45 °C ± 1 °C dans
chaque boîte de Pétri.
− Mélanger doucement l’inoculum et la gélose par rotation des boîtes de Pétri dans le sens
horaire, dans le sens antihoraire et dans un mouvement avant-arrière et latéral. Ne pas
éclabousser la gélose dans le couvercle de la boîte de Pétri.
− Laisser solidifier les géloses sur une surface plane au niveau.
− Placer les géloses dans l’incubateur à 35 °C ± 0,5 °C en position inversée pendant
48 heures ± 3 heures.
Un contrôle de stérilité doit être effectué de la façon suivante :
− verser de 15 ml à 17 ml de gélose R2A tempérée à 45 °C ± 1 °C dans une boîte de Pétri.
Laisser solidifier sur une surface au niveau. Il est recommandé d’effectuer un contrôle de
stérilité par série de 10 échantillons.
7.3. OBSERVATION DES RÉSULTATS
Après la période d’incubation, sortir et ranger les boîtes de Pétri par ordre de numéro d’échantillon.
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7.3.1. Dénombrement
Effectuer les dénombrements à l’aide d’un compteur de colonies. Choisir les boîtes de Pétri dans
lesquelles il y a entre 30 et 300 colonies.
7.3.2. Enregistrement des résultats
Inscrire sur la feuille de travail le nombre de colonies correspondant au volume d’eau analysé et
reporter le résultat par ml.
8. CALCUL ET EXPRESSION DES RÉSULTATS
Les résultats doivent être calculés à l’aide de l’équation générale suivante :
Volume d échantillon analysé en ml
Nombre de colonies dénombrées
UFC ml
′
=
8.1. DÉNOMBREMENT À L’INTÉRIEUR DES LIMITES DE QUANTIFICATION
Les limites de quantification étant situées à 30 et 300 colonies, calculer le résultat en ne retenant que
les boîtes de Pétri contenant entre 30 et 300 colonies.
Exemple :
Si des volumes de 0,1 ml et de 0,01 ml d’un échantillon produisent des dénombrements de 250 et
14 colonies, conserver la valeur de 250 colonies pour exprimer le résultat :
2 500 UFC ml
0,1 ml
250
=
8.2. DÉNOMBREMENT À L’EXTÉRIEUR DES LIMITES DE QUANTIFICATION
8.2.1. Dénombrement lorsque le nombre de colonies isolées est inférieur à la limite de
quantification
Lorsque toutes les géloses analysées contiennent moins de 30 colonies, additionner toutes les
colonies sur l’ensemble des géloses, tout en tenant compte des volumes de l’échantillon
ensemencés.
Exemple :
Si des volumes de 1 ml, 0,1 ml et 0,01 ml d’un échantillon produisent respectivement 28, 4 et
0 colonies, le résultat est le suivant :
MA. 700 – BHA35 1.0 13 de 15
29 UFC ml
1 0,1 0,01
28 4 0
=
+ +
+ +
8.2.2. Dénombrement lorsque aucune colonie n’a été isolée sur les boîtes de Pétri correspondant
à plusieurs volumes analysés d’un échantillon
Calculer le résultat à l’aide du volume d’échantillon le plus grand.
Exemple :
Si des volumes de 0,1 ml, 0,01 ml et 0,001 ml d’un échantillon produisent tous des comptes de
0 colonie, calculer le nombre de colonies par ml qui aurait été rapporté s’il y avait 1 colonie sur la
gélose du plus grand volume d’échantillon utilisé :
10 UFC ml
0,1 ml
1
=
Transmettre ce résultat comme étant :
< 10 UFC/ml
8.2.3. Dénombrement lorsque tous les résultats de plusieurs volumes d’un échantillon sont
au-delà de la limite supérieure de quantification
Calculer le résultat à l’aide de la limite de quantification et du plus faible volume d’échantillon
utilisé.
Exemple :
Si des volumes de 1,0 ml, 0,1 ml et 0,01 ml d’un échantillon produisent respectivement 540, 390 et
320, tous les comptes sont au-delà de la limite de quantification. Estimer le résultat à l’aide du plus
petit volume utilisé et de la limite supérieure de quantification (300 pour les BHAA).
30 000 UFC ml
0,01 ml
300
=
Transmettre ce résultat comme étant :
> 30 000 UFC/ml
8.3. DÉNOMBREMENT EN PRÉSENCE DE COLONIES ENVAHISSANTES
Dans le cas où des colonies envahissantes sont présentes, compter les colonies distinctes et les
colonies envahissantes suivant les conditions énumérées ci-dessous :
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8.3.1. Dénombrement des colonies distinctes
Dénombrer toutes les colonies distinctes si les colonies envahissantes ne couvrent pas plus de la
moitié de la surface de la gélose.
Si les colonies envahissantes couvrent plus de la moitié de la surface de la gélose, rapporter
qualitativement le résultat comme étant : « présence de colonies envahissantes ».
8.3.2. Dénombrement des colonies envahissantes
Dénombrer comme uniques les colonies envahissantes qui sont bien définies et séparées ainsi que
celles différentes par leur aspect.
S’il est impossible de différencier les colonies envahissantes, rapporter qualitativement le résultat
comme étant : « présence de colonies envahissantes ».
9. CRITÈRES D’ACCEPTABILITÉ
Les contrôles de stérilité effectués au moment de l’analyse doivent démontrer l’absence de colonies
de BHAA ou de tout autre microorganisme.
La température de l’incubateur doit être maintenue à 35,0 °C ± 0,5 °C pendant toute la durée de
l’incubation.
Toutes les exigences précisées dans le document DR-12-SCA-02, intitulé « Lignes directrices
concernant l’application des contrôles de la qualité en microbiologie », doivent être respectées.
10. BIBLIOGRAPHIE
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS
ASSOCIATION AND WATER POLLUTION CONTROL FEDERATION, Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th Edition, 1998.
CENTRE D’EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC, Lignes
directrices concernant l’application des contrôles de la qualité en microbiologie,
Ministère de l’Environnement du Québec, DR-12-SCA-02, Édition courante.
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Échantillon
dilutions
transfert des volumes d’échantillon dans les boîtes de Pétri
ajout du milieu R2A à 45 °C ± 1 °C
mélange de l’inoculum et du milieu R2A
solidification des milieux
incubation à 35 °C ± 0,5 °C 48 heures ± 3 heures
dénombrement des colonies
Figure 1 - Schéma du protocole de confirmation des colonies hétérotrophes aérobies et
anaérobies facultatives (BHAA)
