البـــــوابـــة
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
Manuel terrestre de l’OIE 2005 1221
iv) Incuber les cultures cellulaires inoculées pendant 1 à 2 h à 37°C. Quand les récipients de culture
cellulaire sont ouverts à l’environnement, comme les plaques de culture, l’incubation doit être faite dans
un incubateur humidifié, en présence de 5 % de CO2 ;
v) Eliminer l’inoculum et laver la monocouche de cellules 3 fois avec le milieu de culture cellulaire
contenant la trypsine ;
vi) Ajouter un volume approprié de milieu de culture cellulaire de survie dans tous les récipients et incuber
à 37°C pendant 7 jours, tout en observant régulièrement afin de noter l’apparition d’un effet
cytopathogène (ECP). Si aucun ECP n’est observé à la fin de la période d’incubation, le récipient de
culture cellulaire peut être congelé à –70°C, décongelé, et un deuxième passage en aveugle peut être
réalisé comme décrit ci-dessus [étape iii)]. Si un ECP est observé, un aliquot du milieu de culture
cellulaire peut être testé quant à la présence d’un virus hémagglutinant, et peut être collecté et utilisé
comme inoculum pour confirmation par la technique d’immunofluorescence (voir Section B.1.e.
ci-dessous). Des monocouches de cellules MDCK (ou autre lignée cellulaire appropriée), sur lamelles
(tube Leighton, plaques de culture 24 puits) ou dans des chambres de culture sur lame, peuvent être
inoculées à ce propos. La méthode d’isolement est la même que décrite plus haut [étape iii)]. Dans
certains cas, il peut être nécessaire de faire des dilutions de 10 en 10 du virus multiplié en culture
cellulaire afin d’avoir un ECP approprié sur la lame. Les sous-types de SIV peuvent être déterminés
par les tests d’inhibition de l’hémagglutination (IH) et de la neuraminidase (IN).
• Inoculation d’oeufs (14)
i) Utiliser des oeufs de poule embryonnés de 10 à 11 jours d’âge ;
ii) Inoculer 0,1 à 0,3 ml d’inoculum dans la cavité allantoïdienne et le sac amniotique. Beaucoup de
laboratoires inoculent uniquement par voie allantoïdienne avec une sensibilité similaire. Généralement,
4 oeufs sont inoculés par échantillon ;
iii) Incuber les oeufs à 35-37°C pendant 3 à 4 jours et mirer quotidiennement. Les oeufs dont les embryons
meurent dans les 24 h suivant l’inoculation sont éliminés ;
iv) Réfrigérer les oeufs dont les embryons sont morts plus de 24 h après l’inoculation. A la fin de la période
d’incubation, prélever les liquides allantoïdiens et amniotique des oeufs portant des embryons morts et
des oeufs avec des embryons encore viables. Tous les produits des oeufs doivent être considérés
comme potentiellement infectieux et doivent être traités de manière à prévenir l’exposition du
manipulateur au SIV ;
v) Centrifuger les liquides à 1 500-1 900 g pendant 10 à 20 min à 4°C. Transférer le surnageant dans un
autre tube pour analyse ;
vi) Les fluides sont analysés vis-à-vis de la présence de SIV à l’aide d’un test d’hémagglutination (HA)
(voir ci-dessous) ;
vii) Réinoculer les fluides ne présentant pas d’activité hémagglutinante (négatifs pour le SIV) sur oeufs ou
sur cultures cellulaires, comme décrit ci-dessus. L’isolement peut être amélioré en diluant les liquides
de 10 en 10 dans du milieu de culture cellulaire. Des antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu de
culture cellulaire.
• Test d’hémagglutination
i) Préparer une suspension d’érythrocytes à 0,5 % à partir de sang de dindon ou de poulet. Le sang de
dindon est utilisé dans quelques laboratoires des États-Unis d’Amérique, mais il n’est pas recommandé
pour l’identification des isolats européens. Les érythrocytes lavés et les suspensions d’érythrocytes à
0,5 % peuvent être conservés à 4°C pendant 1 semaine. Eliminer en cas d’hémolyse ;
ii) Déposer 50 μl de PBS dans une rangée de 12 puits d’une plaque de microtitrage à 96 puits à fonds en
V- ou en U-, ceci pour chaque virus à identifier. Une rangée supplémentaire de puits doit être incluse
pour un témoin positif ;
iii) Ajouter 50 μl d’isolat non dilué dans le premier puits de chaque rangée correspondante ;
iv) Diluer l’isolat en série à l’aide d’une micropipette réglée pour délivrer 50 μl. Les dilutions résultantes
vont ainsi aller de 1/2 (puits n°1) à 1/2048 (puits n°11). Le puits n°12 contient seulement du PBS et sert
de témoin cellulaire ;
v) Ajouter 50 μl de suspension d’érythrocytes à 0,5 % dans chaque puits et agiter la plaque pour bien
mélanger. Remarque : bien maintenir les érythrocytes en suspension pendant l’étape de distribution ;
vi) Couvrir la plaque avec du film adhésif et incuber à température ambiante jusqu’à ce qu’un culot distinct
se soit formé dans le puits témoin (30 à 60 min) ;
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
1222 Manuel terrestre de l’OIE 2005
vii) Dans les puits où l’hémagglutination est complète (HA positive, SIV présent), les érythrocytes se
dispersent dans tout le puits en formant un tapis continu d’apparence mate au fond de la cupule. Les
puits où les érythrocytes sédimentent au fond de la cupule en formant un culot central sont négatifs au
regard de l’activité hémagglutinante (négatif pour le SIV). Une activité HA incomplète est mise en
évidence par la formation de culots partiels, caractérisés par des bords flous ou ressemblant à des
beignets. Quand l’interprétation entre inhibition complète et incomplète est difficile, incliner la plaque de
microtitration d’environ 45 degrés pendant 20 à 30 secondes et observer le coulage, lequel produit,
dans les puits où l’inhibition est complète, une traînée de cellules, fine, légèrement renflée à son
extrémité et translucide. Les puits où l’inhibition est partielle ne produiront pas de « larme ».
b) Typage des isolats de SIV
• Test d’inhibition de l’hémagglutination
i) Diluer les antigènes HA de référence (H1, H3, etc.) à une concentration de 8 unités HA (HAU) pour
50 μl (4 HAU/25 μl) dans du PBS 0,01 M, pH 7 ;
ii) Standardiser les virus influenza A inconnus afin qu’ils contiennent 8 HAU dans 50 μl ;
iii) Effectuer un nouveau titrage (test d’HA) pour tous les isolats inconnus et les antigènes de sous-type H
afin de vérifier que le nombre d’unités HAU est correct. Le titrage de contrôle est réalisé comme décrit
dans le protocole du test d’HA, à l’exception près que 6 puits de dilutions sont utilisés au lieu de 11 ;
iv) Traiter le sérum au RDE : ajouter 50 μl de sérum à 200 μl de RDE (Receptor-Destroying Enzyme ;
dilué au 1/10 dans une solution saline de calcium, ce qui équivaut à 100 unités par ml). Incuber une
nuit (12 à 18 h) dans un bain-marie à 37°C. Ajouter 150 μl d’une solution de citrate de sodium à 2,5 %
et inactiver le sérum à la chaleur à 56°C pendant 30 min. Mélanger 200 μl d’échantillon traité et 25 μl
de PBS afin de réaliser une dilution au 1/10 du sérum. Remarque : le traitement RDE est recommandé
car il éliminera l’hémagglutination non spécifique et améliorera l’identification des isolats H1N2 et
H3N2 ;
v) Éliminer les agglutinines sériques naturelles en traitant 1 ml de sérum dilué par 0,1 ml d’érythrocytes
concentrés et lavés. Incuber pendant 30 min à température ambiante en mélangeant de temps en
temps afin de maintenir les érythrocytes en suspension. Centrifuger les sérums traités à 800 g pendant
10 min, puis les réserver ;
vi) Distribuer 25 μl d’antigène standardisé (isolat inconnu ou antigène témoin positif) dans 3 puits d’une
plaque de microtitrage à 96 puits à fond en V ou en U. Ajouter 50 μl de PBS dans plusieurs puits qui
serviront de témoin cellulaire érythrocyte. Remarque : 25 μl de PBS peuvent être utilisés à la place des
25 μl d’antigène standardisé ;
vii) Ajouter 25 μl d’antisérum standardisé approprié dans le premier puits du sous-type H devant être testé.
Diluer l’antisérum en série dans les puits antigène, dans un volume de 25 μl, à l’aide d’une pipette
réglée pour délivrer 25 μl. Répéter cette procédure pour chacun des sous-types H devant être testé.
Remarque : si 25 μl de PBS sont utilisés à la place des 25 μl d’antigène standardisé à l’étape vi),
ajouter 25 μl d’antigène standardisé dans chaque puits contenant l’antisérum standardisé ;
viii) Couvrir la (les) plaque(s) et incuber à température ambiante pendant 20 à 60 min ;
ix) Ajouter 50 μl d’une suspension d’érythrocytes à 0,5 % dans chaque puits et agiter la (les) plaque(s)
pour bien mélanger. Bien maintenir les érythrocytes en suspension pendant la phase de répartition ;
x) Couvrir les plaques avec un film adhésif et incuber à température ambiante jusqu’à ce qu’un culot
distinct se soit formé dans les puits témoins positif (généralement 30 à 60 min). Pour évaluer
l’hémagglutination, observer les plaques après environ 20 min d’incubation étant donné que certains
isolats pourraient commencer à éluer (se détacher des érythrocytes) au bout de 30 min ;
xi) Lire les résultats du test comme décrit plus haut pour le test d’HA. Un échantillon est considéré positif
pour un sous-type H donné si l’hémagglutination est inhibée. Le test est considéré valide si l’antigène
de référence positif et son antisérum homologue fournissent le titre IHA attendu et que le titrage de
contrôle de chaque antigène (inconnu et témoin positif) est de 8 HAU. Si ces conditions ne sont pas
respectées, le test doit être répété ;
xii) Si les érythrocytes des puits témoin cellulaire ne se déposent pas en un culot bien formé, tester les
points suivants comme causes possibles : formulation incorrecte du PBS, évaporation excessive à
partir des plaques, érythrocytes trop vieux, ou concentration incorrecte d’érythrocytes.
• Test d’inhibition de la neuraminidase
L’identification du sous-type basée sur le test d’inhibition de la neuraminidase (IN) n’est pas du ressort de
nombreux laboratoires. Les laboratoires de référence doivent être consultés pour le typage N des isolats.
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
Manuel terrestre de l’OIE 2005 1223
c) Épreuve d’immunofluorescence
i) Cette technique peut être utilisée sur des coupes de tissu ou sur des monocouches de cellules
infectées étalées sur lames ou lamelles. Des témoins positifs et négatifs doivent être inclus dans tous
les protocoles de marquage ;
ii) Les cellules inoculées sont incubées pendant une durée de temps appropriée pour que 10 à 25 %
d’entre-elles soient infectées par le virus. Rincer la lamelle ou la lame une fois dans du PBS, la placer
dans 100 % d’acétone pendant 5 à 10 min et sécher à l’air. L’acétone doit être utilisée sous hotte
ventilée ;
iii) Préparer les coupes de tissu congelé sur des lames de verre. Fixer les lames de verre à l’acétone
pendant 5 à 10 min et sécher à l’air ;
iv) Déposer le conjugué (anticorps anti-virus influenza porcin couplé à la fluorescéine) et incuber en
chambre humide à 37°C pendant 30 min ;
v) Laver dans du PBS, pH 7,2, faire tremper pendant 5 à 10 min dans du PBS frais, rincer à l’eau distillée
et sécher à l’air ;
vi) Déposer des lamelles sur les lames de verre, face cellule en bas, avec du milieu de montage. Enlever
le joint d’étanchéité en caoutchouc des chambres de culture sur lame et ajouter du milieu de montage
puis une lamelle de verre. Les coupes de tissu sur lame sont également recouvertes de milieu de
montage et de lamelle ;
vii) Observer les lames marquées dans une chambre noire au microscope à épifluorescence. Les cellules
infectées par du SIV sont identifiées par la présence d’une fluorescence brillante vert pomme. Il est
recommandé que la personne qui examine les lames soit entraînée à la lecture de lames marquées en
fluorescence, car celles-ci peuvent être difficiles à interpréter.
d) Immunohistochimie (19)
i) Découper en sections de 4 μm d’épaisseur des échantillons de poumon préalablement fixés au formol
et inclus dans de la paraffine, et les placer sur des lames recouvertes de poly-L-lysine. Des tissus
témoins positif et négatif doivent être inclus dans tous les tests ;
ii) Chauffer les lames à 60°C pendant 15 min, déparaffiner et réhydrater par immersion dans des
concentrations décroissantes d’éthanol puis dans de l’eau distillée ;
iii) Traiter les échantillons au peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 min et rincer 2 fois à l’eau distillée ;
iv) Digérer les échantillons avec 0,05 % de protéase pendant 2 min et rincer 2 fois 2 min à température
ambiante dans du tampon PBS contenant 0,1 M de Tris, pH 7,2 ;
v) Déposer l’anticorps monoclonal de souris anti-SIV (dirigé contre la nucléoprotéine virale) sur chaque
lame et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4°C pendant la nuit. Rincer les lames avec
du tampon PBS/Tris ;
vi) Déposer l’anticorps secondaire (anticorps de chèvre anti-souris biotinylé) pendant 10 min à
température ambiante. Rincer avec du tampon PBS/Tris ;
vii) Déposer l’anticorps tertiaire (streptavidine conjuguée à la peroxydase) pendant 10 min à température
ambiante. Rincer avec du tampon PBS/Tris ;
viii) Ajouter une solution de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine pendant 5 min à température
ambiante. Rincer 2 fois à l’eau distillée ;
ix) Contre-colorer les lames dans de l’hématoxyline de Gill pendant 10 à 30 s, laver à l’eau pendant 2 min,
déshydrater, clarifier et ajouter les lamelles ;
x) Les tissus infectés par le SIV sont identifiés par la présence de marquage brun dans l’épithélium
bronchique et dans les pneumocytes.
e) ELISA de capture d’antigène
Des épreuves immuno-enzymatiques (ELISA) de capture d’antigènes de type A sont disponibles dans le
commerce pour la détection des virus influenza humains. Ce genre d’essais a été utilisé pour la détection du
SIV dans le tissu pulmonaire et les écouvillons nasaux (10, 17). Les tests sont généralement disponibles
auprès de compagnies pharmaceutiques.
f) Réaction de polymérisation en chaîne par polymérase (PCR)
Des épreuves de réaction de polymérisation en chaîne par polymérase (PCR) ont été développées pour le
diagnostic de la grippe porcine (6). Des informations approfondies sur la validation de ces épreuves ne sont
pas disponibles à l’heure actuelle.
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
1224 Manuel terrestre de l’OIE 2005
2. Épreuves sérologiques
La principale épreuve sérologique pour la détection des anticorps anti-SIV est l’IHA et elle est spécifique du
sous-type. Elle doit être conduite sur des paires de sérums collectés à 10-21 jours d’intervalle. Une augmentation
du titre de 4 fois ou plus, entre le premier et le second prélèvement, suggère une infection SIV récente. Les autres
épreuves sérologiques qui ont été décrites, mais qui ne sont pas couramment utilisées, sont la neutralisation
virale, le test d’immunodiffusion en gélose et l’épreuve d’immunofluorescence indirecte. La technologie ELISA
pour la détection des anticorps anti-SIV a été décrite dans la littérature et au moins une trousse de diagnostic
commerciale a été mise sur le marché. La validation de ce(s) trousse(s) ELISA est (sont) en cours.
• Test d’inhibition de l’hémagglutination
i) Diluer les antigènes HA de référence (H1, H3, etc.) à une concentration de 4 à 8 HAU/25 μl dans du
PBS 0,01 M, pH 7,2 ;
ii) Test H1N1 : Inactiver les sérums à la chaleur pendant 30 min à 56°C. Diluer au 1/10 dans du PBS. A
1 ml de sérum inactivé à la chaleur et dilué, ajouter 0,1 ml d’érythrocytes de poulet concentrés et lavés.
Mélanger. Incuber à température ambiante pendant 30 min en agitant régulièrement toutes les 10 à 15
min. Centrifuger à 800 g pendant 10 min à 4°C. Remarque : les sérums peuvent être traités au RDE et
aux érythrocytes de poulet comme décrit à l’étape iii) ci-dessous au lieu d’être inactivés à la chaleur et
traités aux érythrocytes de poulet ;
iii) Test H1N2 et H3N2 : Ajouter 50 μl de sérum à 200 μl de RDE dilué au 1/10 dans une solution saline de
calcium, ce qui équivaut à 100 unités par ml. Incuber toute la nuit (12 à 18 h) dans un bain-marie à
37°C. Ajouter 150 μl de solution de citrate de sodium à 2,5 % et inactiver à la chaleur à 56°C pendant
30 min. Mélanger 200 μl d’échantillon traité et 25 μl de PBS. Ajouter 50 μl d’une solution d’érythrocytes
de poulet ou de dindon à 50 %, jusqu’à diluer le sérum au 1/10. Agiter et incuber pendant 30 min à
température ambiante ou une nuit à 4°C. Centrifuger à 800 g pendant 10 min à 4°C. Remarque : les
érythrocytes de poulet sont recommandés pour tous les isolats européens ;
iv) Distribuer 50 μl de sérum traité dans 2 puits d’une plaque de 96 puits à fond en V ou en U. Distribuer
25 μl de sérum traité dans 2 puits qui serviront de sérum témoin. Les sérums témoin positif et négatif
sont traités de la même manière que les sérums inconnus ;
v) Distribuer 25 μl de PBS dans les puits témoin pour le sérum et dans tous les puits vides, à l’exception
de 2 puits identifiés comme puits témoin cellulaire. Ajouter 50 μl de PBS dans ces puits témoins
cellulaires ;
vi) Diluer le sérum en série dans la plaque, de 2 en 2, sous 25 μl de volume, puis ajouter 25 μl d’antigène
approprié dans tous les puits du test, à l’exception des puits témoins pour le sérum et les cellules ;
vii) Recouvrir les plaques et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 min ;
viii) Ajouter 50 μl de suspension d’érythrocytes à 0,5 % (poulet pour H1N1 et dindon pour H3N2) dans
chaque puits, agiter et incuber à température ambiante pendant 20 à 30 min jusqu’à ce qu’un culot
distinct se forme au fond des puits témoin cellulaire. Bien maintenir les érythrocytes en suspension
pendant la phase de distribution ;
ix) Préalablement et simultanément à l’IHA, réaliser un test HA sur les antigènes utilisés en IHA afin de
vérifier que leurs concentrations sont appropriées ;
x) Pour que le test soit valide, il ne doit pas y avoir d’hémagglutination dans les puits témoins pour le
sérum, pas d’inhibition de l’hémagglutination avec le sérum négatif, le sérum positif doit fournir le titre
IHA attendu et le titrage HA de contrôle doit indiquer 4 à 8 HAU pour 25 μl.
b) Épreuve immuno-enzymatique (ELISA) (9)
La technologie ELISA pour la détection des anticorps SIV a été décrite dans la littérature. Au moins un test
ELISA est disponible sous forme de trousse de diagnostic commercialisée.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Des recommandations pour la production des vaccins vétérinaires sont données au Chapitre I.1.7., « Principes de
production de vaccins vétérinaires ». Les recommandations données ici et au Chapitre I.1.7. se veulent être
générales par nature et peuvent être complétées par des exigences nationales et régionales.
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
Manuel terrestre
Manuel terrestre de l’OIE 2005 1221
iv) Incuber les cultures cellulaires inoculées pendant 1 à 2 h à 37°C. Quand les récipients de culture
cellulaire sont ouverts à l’environnement, comme les plaques de culture, l’incubation doit être faite dans
un incubateur humidifié, en présence de 5 % de CO2 ;
v) Eliminer l’inoculum et laver la monocouche de cellules 3 fois avec le milieu de culture cellulaire
contenant la trypsine ;
vi) Ajouter un volume approprié de milieu de culture cellulaire de survie dans tous les récipients et incuber
à 37°C pendant 7 jours, tout en observant régulièrement afin de noter l’apparition d’un effet
cytopathogène (ECP). Si aucun ECP n’est observé à la fin de la période d’incubation, le récipient de
culture cellulaire peut être congelé à –70°C, décongelé, et un deuxième passage en aveugle peut être
réalisé comme décrit ci-dessus [étape iii)]. Si un ECP est observé, un aliquot du milieu de culture
cellulaire peut être testé quant à la présence d’un virus hémagglutinant, et peut être collecté et utilisé
comme inoculum pour confirmation par la technique d’immunofluorescence (voir Section B.1.e.
ci-dessous). Des monocouches de cellules MDCK (ou autre lignée cellulaire appropriée), sur lamelles
(tube Leighton, plaques de culture 24 puits) ou dans des chambres de culture sur lame, peuvent être
inoculées à ce propos. La méthode d’isolement est la même que décrite plus haut [étape iii)]. Dans
certains cas, il peut être nécessaire de faire des dilutions de 10 en 10 du virus multiplié en culture
cellulaire afin d’avoir un ECP approprié sur la lame. Les sous-types de SIV peuvent être déterminés
par les tests d’inhibition de l’hémagglutination (IH) et de la neuraminidase (IN).
• Inoculation d’oeufs (14)
i) Utiliser des oeufs de poule embryonnés de 10 à 11 jours d’âge ;
ii) Inoculer 0,1 à 0,3 ml d’inoculum dans la cavité allantoïdienne et le sac amniotique. Beaucoup de
laboratoires inoculent uniquement par voie allantoïdienne avec une sensibilité similaire. Généralement,
4 oeufs sont inoculés par échantillon ;
iii) Incuber les oeufs à 35-37°C pendant 3 à 4 jours et mirer quotidiennement. Les oeufs dont les embryons
meurent dans les 24 h suivant l’inoculation sont éliminés ;
iv) Réfrigérer les oeufs dont les embryons sont morts plus de 24 h après l’inoculation. A la fin de la période
d’incubation, prélever les liquides allantoïdiens et amniotique des oeufs portant des embryons morts et
des oeufs avec des embryons encore viables. Tous les produits des oeufs doivent être considérés
comme potentiellement infectieux et doivent être traités de manière à prévenir l’exposition du
manipulateur au SIV ;
v) Centrifuger les liquides à 1 500-1 900 g pendant 10 à 20 min à 4°C. Transférer le surnageant dans un
autre tube pour analyse ;
vi) Les fluides sont analysés vis-à-vis de la présence de SIV à l’aide d’un test d’hémagglutination (HA)
(voir ci-dessous) ;
vii) Réinoculer les fluides ne présentant pas d’activité hémagglutinante (négatifs pour le SIV) sur oeufs ou
sur cultures cellulaires, comme décrit ci-dessus. L’isolement peut être amélioré en diluant les liquides
de 10 en 10 dans du milieu de culture cellulaire. Des antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu de
culture cellulaire.
• Test d’hémagglutination
i) Préparer une suspension d’érythrocytes à 0,5 % à partir de sang de dindon ou de poulet. Le sang de
dindon est utilisé dans quelques laboratoires des États-Unis d’Amérique, mais il n’est pas recommandé
pour l’identification des isolats européens. Les érythrocytes lavés et les suspensions d’érythrocytes à
0,5 % peuvent être conservés à 4°C pendant 1 semaine. Eliminer en cas d’hémolyse ;
ii) Déposer 50 μl de PBS dans une rangée de 12 puits d’une plaque de microtitrage à 96 puits à fonds en
V- ou en U-, ceci pour chaque virus à identifier. Une rangée supplémentaire de puits doit être incluse
pour un témoin positif ;
iii) Ajouter 50 μl d’isolat non dilué dans le premier puits de chaque rangée correspondante ;
iv) Diluer l’isolat en série à l’aide d’une micropipette réglée pour délivrer 50 μl. Les dilutions résultantes
vont ainsi aller de 1/2 (puits n°1) à 1/2048 (puits n°11). Le puits n°12 contient seulement du PBS et sert
de témoin cellulaire ;
v) Ajouter 50 μl de suspension d’érythrocytes à 0,5 % dans chaque puits et agiter la plaque pour bien
mélanger. Remarque : bien maintenir les érythrocytes en suspension pendant l’étape de distribution ;
vi) Couvrir la plaque avec du film adhésif et incuber à température ambiante jusqu’à ce qu’un culot distinct
se soit formé dans le puits témoin (30 à 60 min) ;
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
1222 Manuel terrestre de l’OIE 2005
vii) Dans les puits où l’hémagglutination est complète (HA positive, SIV présent), les érythrocytes se
dispersent dans tout le puits en formant un tapis continu d’apparence mate au fond de la cupule. Les
puits où les érythrocytes sédimentent au fond de la cupule en formant un culot central sont négatifs au
regard de l’activité hémagglutinante (négatif pour le SIV). Une activité HA incomplète est mise en
évidence par la formation de culots partiels, caractérisés par des bords flous ou ressemblant à des
beignets. Quand l’interprétation entre inhibition complète et incomplète est difficile, incliner la plaque de
microtitration d’environ 45 degrés pendant 20 à 30 secondes et observer le coulage, lequel produit,
dans les puits où l’inhibition est complète, une traînée de cellules, fine, légèrement renflée à son
extrémité et translucide. Les puits où l’inhibition est partielle ne produiront pas de « larme ».
b) Typage des isolats de SIV
• Test d’inhibition de l’hémagglutination
i) Diluer les antigènes HA de référence (H1, H3, etc.) à une concentration de 8 unités HA (HAU) pour
50 μl (4 HAU/25 μl) dans du PBS 0,01 M, pH 7 ;
ii) Standardiser les virus influenza A inconnus afin qu’ils contiennent 8 HAU dans 50 μl ;
iii) Effectuer un nouveau titrage (test d’HA) pour tous les isolats inconnus et les antigènes de sous-type H
afin de vérifier que le nombre d’unités HAU est correct. Le titrage de contrôle est réalisé comme décrit
dans le protocole du test d’HA, à l’exception près que 6 puits de dilutions sont utilisés au lieu de 11 ;
iv) Traiter le sérum au RDE : ajouter 50 μl de sérum à 200 μl de RDE (Receptor-Destroying Enzyme ;
dilué au 1/10 dans une solution saline de calcium, ce qui équivaut à 100 unités par ml). Incuber une
nuit (12 à 18 h) dans un bain-marie à 37°C. Ajouter 150 μl d’une solution de citrate de sodium à 2,5 %
et inactiver le sérum à la chaleur à 56°C pendant 30 min. Mélanger 200 μl d’échantillon traité et 25 μl
de PBS afin de réaliser une dilution au 1/10 du sérum. Remarque : le traitement RDE est recommandé
car il éliminera l’hémagglutination non spécifique et améliorera l’identification des isolats H1N2 et
H3N2 ;
v) Éliminer les agglutinines sériques naturelles en traitant 1 ml de sérum dilué par 0,1 ml d’érythrocytes
concentrés et lavés. Incuber pendant 30 min à température ambiante en mélangeant de temps en
temps afin de maintenir les érythrocytes en suspension. Centrifuger les sérums traités à 800 g pendant
10 min, puis les réserver ;
vi) Distribuer 25 μl d’antigène standardisé (isolat inconnu ou antigène témoin positif) dans 3 puits d’une
plaque de microtitrage à 96 puits à fond en V ou en U. Ajouter 50 μl de PBS dans plusieurs puits qui
serviront de témoin cellulaire érythrocyte. Remarque : 25 μl de PBS peuvent être utilisés à la place des
25 μl d’antigène standardisé ;
vii) Ajouter 25 μl d’antisérum standardisé approprié dans le premier puits du sous-type H devant être testé.
Diluer l’antisérum en série dans les puits antigène, dans un volume de 25 μl, à l’aide d’une pipette
réglée pour délivrer 25 μl. Répéter cette procédure pour chacun des sous-types H devant être testé.
Remarque : si 25 μl de PBS sont utilisés à la place des 25 μl d’antigène standardisé à l’étape vi),
ajouter 25 μl d’antigène standardisé dans chaque puits contenant l’antisérum standardisé ;
viii) Couvrir la (les) plaque(s) et incuber à température ambiante pendant 20 à 60 min ;
ix) Ajouter 50 μl d’une suspension d’érythrocytes à 0,5 % dans chaque puits et agiter la (les) plaque(s)
pour bien mélanger. Bien maintenir les érythrocytes en suspension pendant la phase de répartition ;
x) Couvrir les plaques avec un film adhésif et incuber à température ambiante jusqu’à ce qu’un culot
distinct se soit formé dans les puits témoins positif (généralement 30 à 60 min). Pour évaluer
l’hémagglutination, observer les plaques après environ 20 min d’incubation étant donné que certains
isolats pourraient commencer à éluer (se détacher des érythrocytes) au bout de 30 min ;
xi) Lire les résultats du test comme décrit plus haut pour le test d’HA. Un échantillon est considéré positif
pour un sous-type H donné si l’hémagglutination est inhibée. Le test est considéré valide si l’antigène
de référence positif et son antisérum homologue fournissent le titre IHA attendu et que le titrage de
contrôle de chaque antigène (inconnu et témoin positif) est de 8 HAU. Si ces conditions ne sont pas
respectées, le test doit être répété ;
xii) Si les érythrocytes des puits témoin cellulaire ne se déposent pas en un culot bien formé, tester les
points suivants comme causes possibles : formulation incorrecte du PBS, évaporation excessive à
partir des plaques, érythrocytes trop vieux, ou concentration incorrecte d’érythrocytes.
• Test d’inhibition de la neuraminidase
L’identification du sous-type basée sur le test d’inhibition de la neuraminidase (IN) n’est pas du ressort de
nombreux laboratoires. Les laboratoires de référence doivent être consultés pour le typage N des isolats.
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
Manuel terrestre de l’OIE 2005 1223
c) Épreuve d’immunofluorescence
i) Cette technique peut être utilisée sur des coupes de tissu ou sur des monocouches de cellules
infectées étalées sur lames ou lamelles. Des témoins positifs et négatifs doivent être inclus dans tous
les protocoles de marquage ;
ii) Les cellules inoculées sont incubées pendant une durée de temps appropriée pour que 10 à 25 %
d’entre-elles soient infectées par le virus. Rincer la lamelle ou la lame une fois dans du PBS, la placer
dans 100 % d’acétone pendant 5 à 10 min et sécher à l’air. L’acétone doit être utilisée sous hotte
ventilée ;
iii) Préparer les coupes de tissu congelé sur des lames de verre. Fixer les lames de verre à l’acétone
pendant 5 à 10 min et sécher à l’air ;
iv) Déposer le conjugué (anticorps anti-virus influenza porcin couplé à la fluorescéine) et incuber en
chambre humide à 37°C pendant 30 min ;
v) Laver dans du PBS, pH 7,2, faire tremper pendant 5 à 10 min dans du PBS frais, rincer à l’eau distillée
et sécher à l’air ;
vi) Déposer des lamelles sur les lames de verre, face cellule en bas, avec du milieu de montage. Enlever
le joint d’étanchéité en caoutchouc des chambres de culture sur lame et ajouter du milieu de montage
puis une lamelle de verre. Les coupes de tissu sur lame sont également recouvertes de milieu de
montage et de lamelle ;
vii) Observer les lames marquées dans une chambre noire au microscope à épifluorescence. Les cellules
infectées par du SIV sont identifiées par la présence d’une fluorescence brillante vert pomme. Il est
recommandé que la personne qui examine les lames soit entraînée à la lecture de lames marquées en
fluorescence, car celles-ci peuvent être difficiles à interpréter.
d) Immunohistochimie (19)
i) Découper en sections de 4 μm d’épaisseur des échantillons de poumon préalablement fixés au formol
et inclus dans de la paraffine, et les placer sur des lames recouvertes de poly-L-lysine. Des tissus
témoins positif et négatif doivent être inclus dans tous les tests ;
ii) Chauffer les lames à 60°C pendant 15 min, déparaffiner et réhydrater par immersion dans des
concentrations décroissantes d’éthanol puis dans de l’eau distillée ;
iii) Traiter les échantillons au peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 min et rincer 2 fois à l’eau distillée ;
iv) Digérer les échantillons avec 0,05 % de protéase pendant 2 min et rincer 2 fois 2 min à température
ambiante dans du tampon PBS contenant 0,1 M de Tris, pH 7,2 ;
v) Déposer l’anticorps monoclonal de souris anti-SIV (dirigé contre la nucléoprotéine virale) sur chaque
lame et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4°C pendant la nuit. Rincer les lames avec
du tampon PBS/Tris ;
vi) Déposer l’anticorps secondaire (anticorps de chèvre anti-souris biotinylé) pendant 10 min à
température ambiante. Rincer avec du tampon PBS/Tris ;
vii) Déposer l’anticorps tertiaire (streptavidine conjuguée à la peroxydase) pendant 10 min à température
ambiante. Rincer avec du tampon PBS/Tris ;
viii) Ajouter une solution de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine pendant 5 min à température
ambiante. Rincer 2 fois à l’eau distillée ;
ix) Contre-colorer les lames dans de l’hématoxyline de Gill pendant 10 à 30 s, laver à l’eau pendant 2 min,
déshydrater, clarifier et ajouter les lamelles ;
x) Les tissus infectés par le SIV sont identifiés par la présence de marquage brun dans l’épithélium
bronchique et dans les pneumocytes.
e) ELISA de capture d’antigène
Des épreuves immuno-enzymatiques (ELISA) de capture d’antigènes de type A sont disponibles dans le
commerce pour la détection des virus influenza humains. Ce genre d’essais a été utilisé pour la détection du
SIV dans le tissu pulmonaire et les écouvillons nasaux (10, 17). Les tests sont généralement disponibles
auprès de compagnies pharmaceutiques.
f) Réaction de polymérisation en chaîne par polymérase (PCR)
Des épreuves de réaction de polymérisation en chaîne par polymérase (PCR) ont été développées pour le
diagnostic de la grippe porcine (6). Des informations approfondies sur la validation de ces épreuves ne sont
pas disponibles à l’heure actuelle.
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
1224 Manuel terrestre de l’OIE 2005
2. Épreuves sérologiques
La principale épreuve sérologique pour la détection des anticorps anti-SIV est l’IHA et elle est spécifique du
sous-type. Elle doit être conduite sur des paires de sérums collectés à 10-21 jours d’intervalle. Une augmentation
du titre de 4 fois ou plus, entre le premier et le second prélèvement, suggère une infection SIV récente. Les autres
épreuves sérologiques qui ont été décrites, mais qui ne sont pas couramment utilisées, sont la neutralisation
virale, le test d’immunodiffusion en gélose et l’épreuve d’immunofluorescence indirecte. La technologie ELISA
pour la détection des anticorps anti-SIV a été décrite dans la littérature et au moins une trousse de diagnostic
commerciale a été mise sur le marché. La validation de ce(s) trousse(s) ELISA est (sont) en cours.
• Test d’inhibition de l’hémagglutination
i) Diluer les antigènes HA de référence (H1, H3, etc.) à une concentration de 4 à 8 HAU/25 μl dans du
PBS 0,01 M, pH 7,2 ;
ii) Test H1N1 : Inactiver les sérums à la chaleur pendant 30 min à 56°C. Diluer au 1/10 dans du PBS. A
1 ml de sérum inactivé à la chaleur et dilué, ajouter 0,1 ml d’érythrocytes de poulet concentrés et lavés.
Mélanger. Incuber à température ambiante pendant 30 min en agitant régulièrement toutes les 10 à 15
min. Centrifuger à 800 g pendant 10 min à 4°C. Remarque : les sérums peuvent être traités au RDE et
aux érythrocytes de poulet comme décrit à l’étape iii) ci-dessous au lieu d’être inactivés à la chaleur et
traités aux érythrocytes de poulet ;
iii) Test H1N2 et H3N2 : Ajouter 50 μl de sérum à 200 μl de RDE dilué au 1/10 dans une solution saline de
calcium, ce qui équivaut à 100 unités par ml. Incuber toute la nuit (12 à 18 h) dans un bain-marie à
37°C. Ajouter 150 μl de solution de citrate de sodium à 2,5 % et inactiver à la chaleur à 56°C pendant
30 min. Mélanger 200 μl d’échantillon traité et 25 μl de PBS. Ajouter 50 μl d’une solution d’érythrocytes
de poulet ou de dindon à 50 %, jusqu’à diluer le sérum au 1/10. Agiter et incuber pendant 30 min à
température ambiante ou une nuit à 4°C. Centrifuger à 800 g pendant 10 min à 4°C. Remarque : les
érythrocytes de poulet sont recommandés pour tous les isolats européens ;
iv) Distribuer 50 μl de sérum traité dans 2 puits d’une plaque de 96 puits à fond en V ou en U. Distribuer
25 μl de sérum traité dans 2 puits qui serviront de sérum témoin. Les sérums témoin positif et négatif
sont traités de la même manière que les sérums inconnus ;
v) Distribuer 25 μl de PBS dans les puits témoin pour le sérum et dans tous les puits vides, à l’exception
de 2 puits identifiés comme puits témoin cellulaire. Ajouter 50 μl de PBS dans ces puits témoins
cellulaires ;
vi) Diluer le sérum en série dans la plaque, de 2 en 2, sous 25 μl de volume, puis ajouter 25 μl d’antigène
approprié dans tous les puits du test, à l’exception des puits témoins pour le sérum et les cellules ;
vii) Recouvrir les plaques et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 min ;
viii) Ajouter 50 μl de suspension d’érythrocytes à 0,5 % (poulet pour H1N1 et dindon pour H3N2) dans
chaque puits, agiter et incuber à température ambiante pendant 20 à 30 min jusqu’à ce qu’un culot
distinct se forme au fond des puits témoin cellulaire. Bien maintenir les érythrocytes en suspension
pendant la phase de distribution ;
ix) Préalablement et simultanément à l’IHA, réaliser un test HA sur les antigènes utilisés en IHA afin de
vérifier que leurs concentrations sont appropriées ;
x) Pour que le test soit valide, il ne doit pas y avoir d’hémagglutination dans les puits témoins pour le
sérum, pas d’inhibition de l’hémagglutination avec le sérum négatif, le sérum positif doit fournir le titre
IHA attendu et le titrage HA de contrôle doit indiquer 4 à 8 HAU pour 25 μl.
b) Épreuve immuno-enzymatique (ELISA) (9)
La technologie ELISA pour la détection des anticorps SIV a été décrite dans la littérature. Au moins un test
ELISA est disponible sous forme de trousse de diagnostic commercialisée.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Des recommandations pour la production des vaccins vétérinaires sont données au Chapitre I.1.7., « Principes de
production de vaccins vétérinaires ». Les recommandations données ici et au Chapitre I.1.7. se veulent être
générales par nature et peuvent être complétées par des exigences nationales et régionales.
Chapitre 2.10.11. — Grippe porcine
Manuel terrestre
